Затверджено заступником начальника головного управління ветеринарії Держагропрому СРСР 20.05.1988 р.

НАСТАНОВА

по застосуванню стандарту зеараленону при мікотоксикологічних дослідженнях.

Загальні відомості.

1. Стандарт зеараленону являє собою речовину, отриману екстракцією із культури гриба Fusarium graminearum, очищену методом колоночної хроматографії і перекристалізовану.
2. Стандарт зеараленону призначений для використання в якості свідка при мікотоксикологічних дослідженнях, з метою визначення цього мікотоксину в кормах, харчових продуктах, органах и тканинах тварин, хворівших мікотоксикозом.
3. Зеараленон, 6-10-гідрокси-6-оксо-1-ундецил-b-лактон резорцилової кислоти; емпірична формула С₁₈Н₂₂О₅, являє собою безколірні кристали з температурою плавлення 161-162°С і молекулярною масою 318,4. Зеараленон розчинний в метиленхлориді, бутанолі, хлороформі, ацетонітрилі, ацетоні, диетиловому ефірі, частково розчиняється в гептані, нерозчинний в воді, чотирихлористому вуглеці і диметилформаміді. Має максимум поглинання УФ-світла при 236, 275 і 316 нм. Зеараленон пригодний для застосування впродовж 12 місяців із дня виготовлення при умові зберігання його в темному, сухому месті при температурі 0 - -10°С.
4. Стандарт зеараленону випускається розфасованим по 25 мг в скляних флаконах для лікарських засобів. Для попередження пошкодження флакони упаковані у подвійні поліетиленові мішечки.

Застосування стандарту зеараленону.

1. Відкривають флакон і розчиняють препарат в 15 мл хлороформу. Розчин зберігають в холодильнику при температурі 5-8°С і використовують для якісного визначення цього мікотоксину в піддослідному материалі. (При використанні стандарту для якісних досліджень допускається повне упарювання розчинника і зберігання токсину в кристалічному вигляді).
2. При якісному визначенні зеараленону в піддослідному матеріалі, підготовку зразка для дослідження і саме дослідження проводять по одній із офіційних методик, затвержених Головним управлінням ветеринарії МСГ СРСР. Розчин стандарту зеараленону використовують тільки в якості свідка цього мікотоксину при розшифровці хроматограм. Для цього 5 мкл вищевказаного хлороформеного розчину стандартного зеараленону наносять на хроматографичну пластину паралельно з розчином очищеного екстракту піддослідного зразка. Пластину висушують в потоці повітря і поміщають в вертикальному положенні в хроматографічну камеру з системою розчинників, вказаних в офіційній методиці або з системою ТЕМ (толуол-етилацетат-85%- мурашина кислота в співвідношенні 6:3:1 по об'єму). Коли фронт розчинників піднімається на висоту 10 см, пластину виймають із камери, висушують і розшифровують хроматограму в УФ світлі з довжиною хвилі 365 нм. Зеараленон на хроматограмі проявляється у вигляді плями з Rf 0,5 блакитною флуоресценцією (сіро-блакитним кольором). Для підтвердження хроматограму оприскують свіжеприготованим 15-20% спиртовим розчином червоного міцного ЖЖ. Після прогрівання хроматограми 3-5 хвилин при 110°С зеараленон зафарбовується в оранжево-жовтий колір. Пляму видно при денному світлі.
3. Кількісне визначення зеараленону в піддослідному матеріалі. 10 г стандартного зеараленону переносять за допомогою хлороформу в мірну колбу ємкістю 20 мл. Розчин в колбі перемішують і доводять об'єм його до мітки хлороформом (розчин №1). 2 мл розчину №1 переносять в іншу мірну колбу ємкістю 20 мл, добавляють біля 15 мл хлороформу, вмістиме колби перемішують і доводять обўєм розчину до мітки (розчин №2), 1 мл розчину №1 вміщує 0,5 мг, а розчин №2 - 0,05 мг зеараленону. Екстракт піддослідного зразка, підготовлений для дослідження по одному із вищевказаних офіційних методів, переносять за допомогою хлороформу в мірну колбу ємкістю 10 мл. Об'єм розчину в колбі доводять до мітки. На хроматографічну пластину наносять за допомогою мікрошприцу 1, 2, 4, 6, 8 і 10 мкл піддослідного розчину і 4, 6 і 10 мкл розчину №2 стандартного зеараленону. Розділення екстрактів в тонкому шарі силікагеля і розшифровку хроматограм проводять аналогічно якісному способу. При розшифровці хроматограм знаходять хроматограму піддослідного зразка, на якій кількість зеараленону по інтенсивності флюоресценції ідентична кількості зеараленону на хроматограмі, де нанесено 4 мкл розчину №2. На обох хроматограмах вміст зеараленону дорівнює 0,2 мкг. Для підтвердження результатів оцінки хроматограм, пластини оприскують свіжоприготованим 15-20% спиртовим розчином червоного міцного ЖЖ. На хроматограмах зеараленон зафарбовується, після прогрівання 3-5 хвилин при 110°С, в оранжево-жовтий колір. Пляму видно при денному світлі. Кількість зеараленону в пробі визначають по формулі:
   x = 2 * B * C * 1000 / A * D, де
   Х - кількість зеараленону в піддослідній пробі, в мкг/кг;
   А - об'єм проби, нанесенної на хроматографічну пластину, в мкл;
   В - кількість стандартного зеараленону на хроматограмі-аналозі, в мкл;
   С - загальний об'єм проби в мкл;
   Д - навіска дослідного матеріалу, в г;
   2 - коефіціент, враховуючий втрати в ході аналізу.

Заходи особистої безпеки.

1. При роботі з зеараленоном необхідно користуватися індивідуальними засобами захисту: марлевими повўязками, гумовими рукавицями, захисними окулярами. Всі роботи з зеараленоном проводять у витяжній шафі. Забороняється приймати їжу і курити при роботі з зеараленоном. Забороняється торкатись руками кристалів зеареленону чи його розчинів. Зеараленон токсичний, має естрогенну і ембріотоксичну дію.
2. Після роботи, а також при потраплянні зеараленону або його розчину на шкіру або слизові оболонки, місце потрапляння необхідно ретельно промити водою з милом.
3. Препарат зеараленону і його розчини необхідно зберігати в опечатаній залізній шафі чи сейфі.
4. Облік витрат зеараленону ведуть в спеціальному журналі встановленої форми.

Настанова розроблена Інститутом ветеринарної медицини УААН (лабораторія мікотоксикології).