Затверджено Заступником голови Головного управління ветеринарії Міністерства сільського господарства СРСР 10 квітня 1984 р.

НАСТАНОВА

по застосуванню стеригматоцистину при мікотоксикологічних дослідженнях.

Загальні положення.

  1. Мікотоксин стеригматоцистин представляє собою хімічно чисту речовину, отриману екстракцією з культури гриба і очищену методом адсорбційної колоночної хроматографії.
  2. Стеригматоцистин призначений для використання в якості показника при мікотоксикологічних дослідженнях з метою визначення наявності мікотоксину стеригматоцистину в кормах, продуктах харчування, органах и тканинах тварин, що загинули від мікотоксикозів.
  3. Стеригматоцистин представляє собою кристалічну речовину жовтого кольору з температурою плавлення 246°С и молекулярною масою 324. Емпірична формула його - С18Н12О6. Розчинний в хлороформі, ацетонітрилі, бензолі, ацетоні, діетиловому ефірі, малорозчинний в гексані, петролейному ефірі, нерозчинний у воді. Має максимум поглинання ультрафіолетового світла в області 233, 246, 325 нм. Стеригматоцистин придатний для застосування протягом 1,5 року з дня виготовлення при умові зберігання його в темному сухому місці при температурі не вище 10°С.
  4. Стеригматоцистин випускається розфасованим по 5 мг в скляних флаконах із темного скла для лікарських засобів. Флакони упаковують в картонні коробки з наявністю гнізд, що забеспечують їх цілісність. На кожній упаковці повинна бути етикетка де вказані назва підприємства-виробника, назва препарата, кількості його (мг), номера серії и держконтролю, дати виготовлення, терміну придатності, умов зберігання і позначення ТУ.
  5. Не допускається до застосування препарат, що має порушення упаковки і цілісності флакона, при відсутності етикетки.

Примітки.

Стеригматоцистин застосовують таким способом. Відкривають флакон і розчиняють препарат в 10 мл хлороформу або бензолу. Розчин зберігають в холодильнику і використовують для якісного визначення стеригматоцистину. Для кількісного визначення стеригматоцистину вмістиме флакона переносять в мірну колбу з притертою пробкою об'ємом 10 мл и доводять об'єм розчину до мітки хлороформом или бензолом. 0,5 мл кількісно переносять в мірну колбу с притертою пробкою об'ємом 25 мл, об'єм доводять хлороформом або бензолом до мітки. В 1 мл розчину міститься 10 мкг стеригматоцистину. Розчин зберігають в темному місці при температурі не вище 10°С.

Кількісне визначення стеригматоцистину в кормах.

Із ретельно перемішаного подрібненого середнього зразка зернофуражу, продуктів його переробки, комбікормів відбирають наважку масою 50 г, переносять її в стакан гомогенізатора об'ємом 500 мл, додають 50 мл 4% водного розчину калію хлористого і 250 мл хлороформу. Екстрагують мікотоксин, гомогенізуючи вмістиме стакана протягом 10 - 15 хвилин при 5 тис. об./хв. Потім екстракт відділяють від гомогенату фільтрацією через паперовий фільтр. Фільтрат переносять в ділильну лійку об'ємом 500 мл. Після повного поділу шарів нижній шар (хлороформовий) зливають і фільтрують через паперовий фільтр у випарювальну фарфорову чашку. Екстракт випарюють під тягою на водяній бані при температурі 60°С досуха. Потім залишок екстракту в фарфоровій чашці розчиняють сумішшю 50 мл ацетонітрилу і 20 мл 4% водного розчину хлористого калію, переносять в ділильну лійку і додають 40 мл гексану. Вмістиме лійки добре перемішують. Після повного поділу шарів гексан видаляють в окрему посудину. Екстракт повторно обробляють 40 мл гексану. Після видалення другої порції гексану до екстракту додають 10 мл дистильованої води і 30 мл хлороформу, вмістиме лійки перемішують. Після повного розділення шарів нижній змішаний хлороформовий шар зливають і фільтрують через паперовий фільтр у випарювальну фарфорову чашку. Для зневоднення екстракту на поверхню фільтра насипають 5 г сульфату натрію, екстракт випарюють під тягою на водяній бані при температурі 60°С досуха. Сухий або маслянистий залишок екстракту в фарфоровій чашці розчиняють в 3 мл хлороформу або бензолу, кількісно переносять в калібровану (з міткою 3мл) пробірку. На хроматографічну пластинку "Силуфол УФ-254" наносять паралельно з допомогою мікро шприца 1, 2, 4, 6, 8, і 10 мкл досліджуваного розчину і 1, 2, 4, 6, 8, і 10 мкл розчину показника стеригматоцистину. Точки нанесення обох розчинів повинні бути на відстані не менше 1 см один від одного і 1.5 см від бокового краю пластини. Наносити розчини на хроматографічну пластинку необхідно в потоці теплого повітря, використовуючи для цього ФЕН. Розмір плями, нанесеної на пластину розчину, не повинен перевищувати 5 мм. Потім пластину ставлять у вертикальному положенні в хроматографічну камеру, дно якої заповнене системою розчинників толуол-етилацетат-85% мурашина кислота (6:3:1). Після того, як фронт розчинників підійметься на висоту 10 -12 см від старту, пластину виймають з камери, підсушують в потоці теплого повітря до зникнення запаху розчинників. Хроматограму проглядають в УФ-променях довжиною хвилі 365 нм. Порівнюючи хроматограму стандартного розчину стеригматоцистину з хроматограмою досліджуваного зразка, виясняють чи є в ньому речовина, аналогічна за світінням і Rf стандарту мікотоксину. З метою додаткової ідентифікації стеригматоцистину і збільшення чутливості, пластину обробляють обприскуванням з пульверизатора 20% спиртовим розчином алюмінію хлористого і після обробки прогрівають 10 хв. при температурі 80°С і проглядають в УФ-променях. Під дією AlCl3 стеригматоцистин змінює флуоресценцію від цегляно-червоної до лимонно-жовтої. При перегляді хроматограм виявляють мінімальну кількість стеригматоцистину, що знаходять на хроматограмі в УФ-променях. Вона складає 0,003 мкг. Якщо на хроматограмі в мінімальному об'ємі досліджуваного розчину є пляма стеригматоцистину, що за інтенсивністю світіння переважає ту, яка гранично виявляється, то вихідний об'єм досліджуваного розчину розбавляють в 2 і більше разів до досягнення на хроматограмах гранично виявлюваного світіння мікотоксину.
Розрахунок проводиться за формулою:
Х= 2·0,003·V2·100/V1·М мкг/кг, де
Х - вміст стеригматоцистину в досліджуваній пробі, в мкг/кг;
V2 - загальний об'єм досліджуваного розчину, в мл;
V1 - мінімальний об'єм досліджуваного розчину (в мл), в якій на хроматограмі встановлено в УФ-променях гранично виявлюване світіння стеригматоцистину;
0,003 - мінімальна кількість стеригматоцистину (в мкг), що виявляється в УФ-променях на пластинці "Силуфол УФ-254"
М - наважка досліджуваного зразка в г;
1000 - переведення в кг;
2 - коефіцієнт, що враховує втрати речовини в ході аналізу.

Заходи особистої профілактики.

При роботі із стеригматоцистином необхідно користуватися гумовими рукавичками. Всі роботи проводити у витяжній шафі. У випадку попадання культуральної маси гриба, екстракту гриба або розчину стеригматоцистину на шкіру, необхідно місце попадання його ретельно промити водою з милом або 1% розчином питної соди. Зберігають стеригматоцистин в опечатаному сейфі або в металевій шафі, при дотриманні вимог, вказаних вище. Облік витрат стеригматоцистину ведуть в спеціальному журналі встановленої форми.

Настанова розроблена Українським науково-дослідним ветеринарним інститутом ( лабораторія мікотоксикології).