Утверждено Заместителем начальника Главного управления ветеринарии Госагропрома СССР 20.05.1988г.

НАСТАВЛЕНИЕ

по применению стандарта зеараленона при микотоксикологических исследованиях.

Общие сведения.

  1. Стандарт зеараленона представляет собой вещество, полученное экстракцией из культуры гриба Fusarium graminearum, очищенное методом колоночной хроматографии и перекристаллизованное.
  2. Стандарт зеараленона предназначен для использования в качестве свидетеля при микотоксикологических исследованиях, с целью определения наличия этого микотоксина в кормах, пищевых продуктах, органах и тканях животных, болевших микотоксикозом.
  3. Зеараленон, 6-10-гидрокси-6-оксо-1-ундецил-b-лактон резорциловой кислоты; эмпирическая формула С18Н22О5, представляет собой бесцветные кристаллы с температурой плавления 161-162°С и молекулярной массой 318,4. Зеараленон растворим в метиленхлориде, бутаноле, хлороформе, ацетонитриле, ацетоне, диэтиловом эфире, частично растворим в гептане, нерастворим в воде, четыреххлористом углероде и диметилформамиде. Имеет максимум поглощения УФ-света при 236, 275 и 316 нм. Зеараленон пригоден для применения в течение 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения его в темном, сухом месте при температуре 0 - -10°С.
  4. Стандарт зеараленона выпускается расфасованным по 25 мг в стеклянных флаконах для лекарственных средств. Для избежания повреждения флаконы упаковываются в двойные полиэтиленовые мешочки.

Применение стандарта зеараленона.

  1. Применяют стандарт зеараленона следующим образом. Вскрывают флакон и растворяют препарат в 15 мл хлороформа. Раствор хранят в холодильнике при температуре 5-8°С и используют для качественного определения этого микотоксина в исследуемом материале. (При использовании стандарта для качественных исследований допускается полное упаривание растворителя и хранение токсина в кристаллическом виде).
  2. При качественном определении зеараленона в исследуемом материале, подготовку образца к исследованию и само исследование проводят по одной из официальных методик, утвержденных Главным управлением ветеринарии МСХ СССР. Раствор стандарта зеараленона используют только в качестве свидетеля этого микотоксина при расшифровке хроматограмм. Для этого 5 мкл вышеуказанного хлороформенного раствора стандартного зеараленона наносят на хроматографическую пластину параллельно с раствором очищенного экстракта исследуемого образца. Пластину высушивают в потоке воздуха и помещают в вертикальном положении в хроматографическую камеру с системой растворителей, указанных в официальной методике или с системой ТЭМ (толуол-этилацетат-85%-ная муравьиная кислота в соотношении 6:3:1 по объему). Когда фронт растворителей поднимется на высоту 10 см, пластину вынимают из камеры, высушивают и расшифровывают хроматограмму в УФ свете длиной волны 365 нм. Зеараленон на хроматограмме проявляется в виде пятна с Rf 0,5 флуоресцирующего голубым (серо-голубым цветом). Для подтверждения хроматограмму опрыскивают свежеприготовленным 15-20%спиртовым раствором красного прочного ЖЖ. После прогревания хроматограммы 3-5 минут при 110°С зеараленон окрашивается в оранжево-желтый цвет. Пятно видно при дневном свете.
  3. Количественное определение зеараленона в исследуемом материале. 10 г стандартного зеараленона переносят с помощью хлороформа в мерную колбу емкостью 20 мл. Раствор в колбе перемешивают и доводят объем его до до метки хлороформом (раствор №1). 2 мл раствора №1 переносят во вторую мерную колбу емкостью 20 мл, прибавляют около 15 мл хлороформа, содержимое колбы перемешивают и доводят объем раствора до метки (раствор №2), 1 мл раствора №1 содержит 0,5 мг, а раствор №2 - 0,05 мг зеараленона. Экстракт исследуемого образца, подготовленный к испытанию по одному из вышеуказанных официальных методов, переносят с помощью хлороформа в мерную колбу емкостью 10 мл. Объем раствора в колбе доводят до метки. На хроматографическую пластину наносят с помощью микрошприца 1, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл испытуемого раствора и 4, 6 и 10 мкл раствора №2 стандартного зеараленона. Разделение экстрактов в тонком слое силикагеля и расшифровку хроматограмм проводят аналогично качественному способу. При расшифровке хроматограмм находят хроматограмму испытуемого образца, на которой количество зеараленона по интенсивности свечения идентично количеству зеараленона на хроматограмме, где нанесено 4 мкл раствора №2. На обоих хроматограммах содержание зеараленона равно 0,2 мкг. Для подтверждения результатов оценки хроматограмм, пластины опрыскивают свежеприготовленным 15-20%спиртовым раствором красного прочного ЖЖ. На хроматограммах зеараленон окрашивается, после прогревания 3-5 минут при 110°С, в оранжево-желтый цвет. Пятно видно при дневном свете. Количество зеараленона в пробе определяют по формуле:
    x = 2 * B * C * 1000 / A * D, где
    Х - содержание зеараленона в исследуемой пробе, в мкг/кг;
    А - объем пробы, нанесенной на хроматографическую пластину, в мкл;
    В - количество стандартного зеараленона на хроматограмме-аналоге, в мкл;
    С - общий объем пробы в мкл;
    Д - навеска испытуемого материала, в г;
    2 - коеффициент, учитывающийй потери в ходе анализа.

Меры личной безопасности.

  1. При работе с зеараленоном необходимо пользоваться индивидуальными средствами защиты: марлевыми повязками, резиновыми перчатками, защитными щитками или очками. Все работы с зеараленоном проводят в вытяжном шкафу. Запрещается принимать пищу и курить при работе с зеараленоном. Запрещается прикасаться руками к кристаллам зеареленона или его растворам. Зеараленон токсичен, обладает эстрогенным и эмбриотоксическим действием.
  2. После работы, а также при попадании зеараленона или его раствора на кожу или слизистые оболочки, место попадания необходимо тщательно промыть водой с мылом.
  3. Препарат зеараленона и его растворы необходимо хранить в опечатаном железном шкафу или сейфе.
  4. Учет расхода зеараленона ведут в специальном журнале установленной формы.

Наставление разработано Институтом ветеринарной медицины УААН (лаборатория микотоксикологии).