Утверждено Заместителем начальника Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 10 апреля 1984 г.

НАСТАВЛЕНИЕ

по применению стеригматоцистина при микотоксикологических исследованиях

Общие положения.

  1. Микотоксин стеригматоцистин представляет собой химически чистое вещество, полученное экстракцией из культуры гриба и очищенное методом адсорбционной колоночной хроматографии.
  2. Стеригматоцистин предназначен для использования в качестве свидетеля при микотоксикологических исследованиях с целью определения наличия микотоксина стеригматоцистина в кормах, пищевых продуктах, органах и тканях животных, павших от микотоксикозов.
  3. Стеригматоцистин представляет собой кристаллическое вещество желтого цвета с температурой плавления 246°С и молекулярной массой 324. Эмпирическая формула его - С18Н 12О6. Растворим в хлороформе, ацетонитриле, бензоле, ацетоне, диэтиловом эфире, частично растворим в гексане, петролейном эфире, нерастворим в воде. Имеет максимум поглощения ультрафиолетового света в области 233, 246, 325 нм. Стеригматоцистин пригоден для применения в течение 1,5 лет со дня изготовления при условии хранения его в темном сухом месте при температуре не выше 10°С.
  4. Стеригматоцистин выпускается расфасованным по 5 мг в стеклянных флаконах из темного стекла для лекарственных средств. Флаконы упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд, обеспечивающих их целостность. На каждой упаковке должна быть этикетка с указанием предприятия-изготовителя, наименования препарата, количества его (мг), номера серии и госконтроля, даты изготовления, срока годности, условий хранения и обозначения ТУ.
  5. Не допускается к применению препарат, имеющий нарушение упаковки и целостности флакона, при отсутствии этикетки.

Примечание.

Стеригматоцистин применяют следующим образом. Вскрывают флакон и растворяют препарат в 10 мл хлороформа или бензола. Раствор хранят в холодильнике и используют для качественного определения стеригматоцистина. Для количественного определения стеригматоцистина содержимое флакона переносят в мерную колбу с притертой пробкой емкостью 10 мл и доводят объем раствора до метки-хлороформом или бензолом. 0,5 мл количественно переносят в мерную колбу с притертой пробкой емкостью 25 мл, объем раствора в колбе доводят хлороформом или бензолом до метки. В 1 мл раствора содержится 10 мкг стеригматоцистина. Раствор хранят в темном месте при температуре не выше 10°С.

Количественное определение стеригматоцистина в кормах.

Из тщательно перемешанного измельченного среднего образца зернофуража, продуктов его переработки, комбикормов отбирают навеску массой 50 г, переносят ее в стакан гомогенизатора емкостью 500 мл, добавляют 50 мл 4%-ного водного раствора калия хлористого и 250 мл хлороформа. Экстрагируют микоток-син, гомогенизируя содержимое стакана в течение 10-15 минут при 5 тыс. об/мин. Затем экстракт отделяют от гомогената фильтрацией через бумажный фильтр. Фильтрат переносят в делительную воронку емкостью 500 мл. После полного разделения слоев нижний слой (хлороформенный) сливают и фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную фарфоровую чашку. Экстракт выпаривают под тягой на водяной бане при температуре 60°С досуха. Затем остаток экстракта в фарфоровой чашке растворяют смесью 50 мл ацетонитрила и 20 мл 4%-ного водного раствора хлористого калия, переносят в делительную воронку и прибавляют 40 мл гексана. Содержимое воронки хорошо перемешивают. После полного разделения слоев гексан удаляют в отдельную посуду. Экстракт повторно обрабатывают 40 мл гексана. После удаления второй порции гексана к экстракту прибавляют 10 мл дистиллированной воды и 30 мл хлороформа, содержимое воронки перемешивают. После полного разделения слоев нижний смешанный хлороформенный слой сливают и фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную фарфоровую чашку. Для обезвоживания экстракта на поверхность фильтра насыпают 6 г сульфата натрия, экстракт выпаривают под тягой на водяной бане при температуре 60°С досуха. Сухой или маслянистый остаток экстракта в фарфоровой чашке растворяют в 3 мл хлороформа или бензола, количественно переносят в калиброванную (с меткой 3 мл) пробирку. На хроматографическую пластинку "Силуфол УФ-254" наносят параллельно с помощью микрошприца 1, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл испытываемого раствора и 1, 2, 4, 6, 8 и 10 мкл раствора свидетеля стеригматоцистина. Точки нанесения обоих растворов должны быть на расстоянии не менее 1 см друг от друга и 1,5 см от бокового края пластины. Наносить растворы на хроматографическую пластину необходимо в потоке теплого воздуха, используя для этой цели ФЭН. Размер пятна, нанесенного на пластину раствора, не должен превышать 5 мм. Затем пластину помещают в вертикальном положении в хроматографическую камеру, дно которой заполнено системой растворителей толуол-этил-ацетат-85%-ная муравьиная кислота (6:3:1). После того, как фронт растворителей поднимется на высоту 10-12 см от старта, пластину вынимают из камеры, подсушивают в потоке теплого воздуха до удаления запаха растворителей. Хроматограмму просматривают в УФ-лучах длиной волны 365 нм. Сравнивая хроматограмму стандартного раствора стеригматоцистина с хрома-тограммой испытуемого образца, выясняют, имеется ли в нем вещество, аналогичное по свечению и Rf стандарту микотоксина. С целью дополнительной идентификации стеригматоцистина и увеличения чувствительности, пластину обрабатывают путем опрыскивания из пульверизатора 20%-ным спиртовым раствором алюминия хлористого и после обработки прогревают 10 минут при температуре 80°С и просматривают в УФ-лучах. Под действием А1Сl3 стеригматоцистин меняет флуоресценцию от кирпично-красной до лимонно-желтой. При просмотре хромато-грамм выявляют предельно минимальное количество стеригматоцистина, обнаруживаемое на хроматограмме в УФ-лучах. Оно составляет 0,003 мкг. Если на хроматограмме в минимальном объеме испытываемого раствора имеется пятно стеригматоцистина по интенсивности свечения превосходящее предельно выявляемое, то исходный объем испытываемого раствора разбавляют в 2 и более раз до достижения на хроматограммах предельно выявляемого свечения микотоксина.
Расчет производится по формуле:
Х = 2 * 0,003 * Y2 * 1000 / Y1 * М мкг/кг, где
X - содержание стеригматоцистина в исследуемой пробе, в мкг/кг;
Y2 - общий объем испытываемого раствора, в мл;
Y1 - минимальный объем испытываемого раствора (в мл), в котором на хроматограмме установлено в УФ-лучах предельно выявляемое свечение стеригматоцистина;
0,003 - минимальное количество стеригматоцистина (в мкг), выявляемое в УФ-лучах на пластине "Силуфол УФ-254";
М - навеска исследуемого образца, в г;
1000 - перевод в кг;
2 - коэффициент, учитывающий потери вещества в ходе анализа.

Меры личной профилактики.

При работе со стеригматоцистином необходимо пользоваться резиновыми перчатками. Все работы проводить в вытяжном шкафу. В случае попадания культуральной массы гриба, экстракта гриба или раствора стеригматоцистина на кожу, необходимо место попадания его тщательно промыть водой с мылом или 1%-ным раствором питьевой соды. Хранят стеригматоцистин в опечатанном сейфе или в металлическом шкафу, при соблюдении условий, указанных выше. Учет расхода стеригматоцистина ведут в специальном журнале установленной формы.

Наставление разработано Украинским научно-исследовательским ветеринарным институтом ( лаборатория микотоксикологии).